导读：  2020年12月16日，中国医学科学院基础医学研究所宋伟课题组和余佳课题组合作在基因组学领域重要期刊Genome Research发表了题为“Panoramic transcriptome analysis and functional screening of long noncoding RNAs in mouse spermatogenesis”的研究长文。本研究全面描绘了lncRNA在小鼠精子发生过程中的动态转录组图谱，联合快速高效的在体精子发生及功能评价模型筛选出具有潜在调控功能的lncRNA，并在单细胞尺度详细解析了lncRNA Gm4665在精子形成时期的重要生理功能。

文章链接：https://genome.cshlp.org/content/early/2020/12/16/gr.264333.120.full.pdf+html

精子发生（Spermatogenesis）是睾丸组织内精密调控的细胞分化过程，主要由有丝分裂、减数分裂和精子形成三个阶段组成。在哺乳动物的各类器官发育中，精子发生呈现出最为丰富的转录组多样性，特别是长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）尤其显著。据研究报道，lncRNA在多个物种的睾丸组织中均富集程度最高，这一表达格局在不同物种间高度保守，提示lncRNA与精子发生之间存在特殊联系。LncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，通常认为它们几乎不编码蛋白质，而是以RNA 的形式与核酸和蛋白质发生广泛相互作用，在器官发育或细胞分化过程中发挥关键的调控功能。迄今为止，在人类和其它哺乳动物的睾丸基因组中已鉴定发现了大量特异表达的lncRNA，然其在精子发生中的生理功能及作用机制仍不清楚。因此，深入解析lncRNA在精子发生中的动态表达全貌以及开发快速有效的功能性lncRNA筛选策略与哺乳动物研究模型，将有助于进一步发现精子发生中lncRNA的生理功能及作用机理。

LncRNA研究的重要命题是其时空表达和生理功能。该研究围绕这两个方面对精子发生中功能性lncRNA展开详细解析。研究人员首先从小鼠睾丸中分离6种类型的生精细胞，通过RNA-seq描绘lncRNA在精子发生中的动态转录组图谱，并鉴定出8418个已注释lncRNA以及523个全新未注释lncRNA；深入分析发现lncRNA与其邻近的第一个蛋白编码基因相关性最强，且两者的基因组相对位置影响其表达相关性；此外，还鉴定了968个生精细胞特征性（signature） lncRNA，其中精子变形时期的表达比例最高（占36.3%）；通过与重要蛋白编码基因的共定位或共表达分析，对精子发生中动态变化的lncRNA进行了功能注释，并采取严格的筛选标准最终获得27个潜在的功能性lncRNA。

图 1 小鼠精子发生过程中lncRNA动态转录组图谱。

由于lncRNA在长度、结构、功能、基因座等方面的复杂性及较低的保守性，体内鉴定功能性lncRNA存在诸多困难。DNA水平缺失（Knockout）是研究功能性生精基因的理想模型，然而该技术并不适合靶向所有类型的lncRNA，整个lncRNA基因座位的缺失可能存在一定的脱靶效应，例如导致基因调控元件或其它功能基因的缺失[11]。因此，RNA水平缺失（Knockdown）是体内研究功能性lncRNA的另一有效策略。该研究结合改良的腺相关病毒运载系统（AAV）和睾丸网显微注射技术构建了小鼠在体精子发生及功能评价模型，利用AAV-shRNA介导的基因敲降可在体内水平有效抑制lncRNA表达，通过评估睾丸组织重量、成熟精子数量、曲细精管形态、生精细胞缺失及凋亡等指标快速筛选精子发生中的功能性lncRNA。利用该研究模型筛选发现3个在精子发生中发挥重要生理功能的lncRNA（Gm4665, 1700027A15Rik, 1700052I22Rik）：体内水平敲降后，可造成睾丸组织重量下降及圆形精子和长形精子细胞的数量明显减少。

图 2 小鼠在体精子发生及功能评价模型。

随后，研究人员巧妙联合在体生精功能研究模型和单细胞转录组测序（Single-cell RNA-seq）进一步在单细胞尺度解析lncRNA Gm4665敲降后特定生精细胞群体圆形精子和长形精子转录图谱的变化，发现该lncRNA敲降后导致一系列功能性生精基因（Ip6k1, Akap3, Hook1, Ropn1, Map7）表达下调；拟时序分析（Pseudotime analysis）表明精子发生早期发育正常（SPG，plpSC，pacSC），但是精子发生晚期发育出现异常，主要表现为圆形精子（rST）向长形精子（elST）分化受阻。机制上，通过ChIRP-seq发现lncRNA Gm4665主要富集在功能性生精基因（包括Ip6k1, Akap3及Hook1等）的启动子活性区域或染色质开放区域，该lncRNA敲降后能够在转录水平抑制功能性生精基因的表达，从而导致圆形精子向长形精子分化异常。

图 3 单细胞尺度解析lncRNA Gm4665在精子发生中的作用机制。

综上，该研究系统性描绘了小鼠精子发生过程中lncRNA的动态表达图谱，并开发了哺乳动物睾丸组织内筛选功能性lncRNA的在体生精功能研究模型，从“系统发现”、“功能筛选”到“机制解析”多个层面阐释了lncRNA对精子发生的重要性，为lncRNA在雄性生殖发育领域的进一步研究提供了资源（resource）和范式（paradigm）。

【摘要】Long noncoding RNAs (lncRNAs) have emerged as diverse functional regulators involved in mammalian development; however, large-scale functional investigation of lncRNAs in mammalian spermatogenesis in vivo is lacking. Here, we delineated the global lncRNA expression landscape in mouse spermatogenesis, and identified 968 germ cell signature lncRNAs. By combining bioinformatics and functional screening, we identified 3 functional lncRNAs (Gm4665, 1700027A15Rik and 1700052I22Rik) that directly influence spermatogenesis in vivo. Knocking down Gm4665 hampered the development of round spermatids into elongating spermatids, and disrupted key spermatogenic gene expression. Mechanistically, lncRNA Gm4665 localized in the nucleus of round spermatids and occupied the genomic regulatory region of important spermatogenic genes including Ip6k1 and Akap3. These findings provide a valuable resource and framework for future functional analysis of lncRNAs in spermatogenesis and their potential roles in other biological processes.

该研究由中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室宋伟课题组和余佳课题组合作完成。基础医学研究所重点实验室李凯助理研究员、徐嘉悦博士后和罗艳云博士为该论文的共同第一作者，宋伟研究员、余佳研究员和马艳妮副研究员为该论文共同通讯作者。本研究工作得到中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2017-I2M-3-009, 2016-I2M-1-001, 2017-I2M-1-015）等项目的资助。

医学分子生物学国家重点实验室