导读：彭小忠课题组于2019年5月在”Dev Cell” 杂志发表研究论文“Opposing Gradients of MicroRNA Expression Temporally Pattern Layer Formation in the Developing Neocortex”。研究者发现了在大脑新皮层发育过程中呈现相反表达梯度的miRNAs，并且这些浓度梯度表达的miRNAs能决定大脑皮层层次形成的时序性。该研究为哺乳动物发育过程中的时间模式提供了一种新的分子机制，以及为深入理解大脑皮层层次形成的机制提供新的理论依据。

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细胞多样性产生的机制是一直是发育生物学研究中的基本科学问题，其核心就是干细胞通过协调时间（Temporal）和空间（Spatial）之间的信息，从而在合适的时间和部位生成种类多样和数量适当的子代细胞。目前而言，空间线索导致细胞多样化已被充分研究，比如不同类型的神经元和神经胶质细胞沿着前后轴或背腹轴生成的调控机制。但时间信息如何控制细胞命运有序决定仍然知之甚少，并且已有研究大多集中于无脊椎动物中。一般认为时间图式形成（temporal patterning）包含两个层面内容：一是子代细胞时序性身份（temporal identity）的特化，也就是单个干细胞依次分裂产生不同类型的子代细胞；二是干细胞分化潜能（competence）的时序性改变。因此，对时间图式形成进行研究有助于揭示谱系命运调控机制，也有助于了解干细胞分化潜能改变甚至衰老的内在机制。

    哺乳动物大脑新皮层的发育过程本质上是神经干细胞时间信息调控的过程。移植实验以及神经干细胞谱系追踪（lineage-tracing）等实验发现不同层次神经元的命运在相应的神经祖细胞(Neural progenitor cells)时期就被决定了，而且祖细胞的命运呈现按时间发展而逐步改变。端脑背侧的神经祖细胞拥有一个内源性机制能够引导其依次产生不同层次的皮层投射神经元，从而形成大脑新皮质的I-VI层的分层结构。这种有序的分层结构是执行认知、意识等高级功能的基础，同时其发育异常也是自闭症、智力障碍等疾病的发病基础。因此哺乳动物大脑新皮层的发育也是神经生物学的研究热点之一。

彭小忠团队分别使用Emx1-cre，D6-cre，hGFAP-cre介导Dicer条件敲除小鼠揭示了miRNA对大脑新皮层不同类型神经元生成是必须的。Dicer缺失的皮层呈现神经元的层次定位错乱，部分神经元命运紊乱（如同一神经元同时表达多个层次的标志基因），以及部分类型神经元缺失等表型，但是该过程不影响神经组细胞的增殖以及神经元的生成。该结果同时也纠正了前期报道的miRNA对大脑新皮层发育的影响是通过调控干细胞数量实现的观点。

该团队对近300个miRNAs在皮层发育不同时间点的时空表达特征进行原位杂交分析（部分结果发表在J Biol Chem 294, 3444-3453.）来探索具体参与大脑新皮层神经前体细胞时序性命运决定中的miRNAs。结果发现了部分miRNAs在皮层神经元发育过程中的神经祖细胞中表达，而且呈现时序性的浓度梯度，其中包含了浓度递减（如miR-128）和递增（如let-7b）两大类。

由于小鼠子宫内电转技术（in utero electroporation）能很好的示踪皮层发育的有序性，同时也能有效地在皮层发育不同时期的祖细胞中进行“gain of function”实验及“loss of function”的功能探索。因此该团队利用该技术对筛选到对象miRNAs进行功能探索。分别在小鼠发育E12.5、E13.5、E14.5时期过表达目标miRNAs或利用miRNA Sponge来功能性抑制相应miRNAs的活性后发现miR-128，miR-9和let-7这三个miRNAs在新皮层不同层次的命运特化过程中的功能各不相同，三者分别在不同时间窗口期内促进第VI层，第V层和第IV-II层神经元的生成，从而控制不同层次的投射神经元时序性生成。

进一步利用Tα1启动子在神经元中过表达以上miRNA后发现，以上miRNAs是通过调控神经祖细胞来决定不同类型神经元命运的。随后发现相反浓度梯度表达的miR-128及let-7能相互拮抗对方的功能，而且功能上相互拮抗的miR-128/miR-9和let-7在神经发生过程中通过它们的相对水平的变化来调控神经祖细胞的命运决定，进而依次生成由深到浅不同层次神经元。同时，该团队发现了梯度表达的miRNA对皮层神经祖细胞的分化潜能具有调控作用，但该过程存在一定的时间窗口期。这些发现揭示了神经祖细胞谱系时序性命运决定以及分化潜能调控中的一种新的分子机制，将为深入理解神经细胞多样性产生的机制甚至为基于干细胞治疗多种神经相关疾病提供新的理论依据。

      彭小忠研究员和耶鲁大学钟伟民教授为本研究共同通讯作者，彭小忠课题组舒鹏程博士和吴超博士为本研究共同第一作者。本研究受到国家重点研发专项、国家自然基金委和中国医学科学院医学与健康科技创新工程等资助。

【摘要】The precisely timed generation of different neuronal types is a hallmark of development from invertebrates to vertebrates. In the developing mammalian neocortex, neural stem cells change competence over time to sequentially produce six layers of functionally distinct neurons. Here, we report that microRNAs (miRNAs) are dispensable for stem-cell self-renewal and neuron production but essential for timing neocortical layer formation and specifying laminar fates. Specifically, as neurogenesis progresses, stem cells reduce miR-128 expression and miR-9 activity but steadily increase let-7 expression, whereas neurons initially maintain the differences in miRNA expression present at birth. Moreover, miR-128, miR-9, and let-7 are functionally distinct; capable of specifying neurons for layer VI and layer V and layers IV, III, and II, respectively; and transiently altering their relative levels of expression can modulate stem-cell competence in a neurogenic-stage-specific manner to shift neuron production between earlier-born and later-born fates, partly by temporally regulating a neurogenesis program involving Hmga2.